Javascript ist derzeit in Ihrem Browser deaktiviert.Mehrere Funktionen dieser Website funktionieren nicht, wenn Javascript deaktiviert ist.freier Zugang zu wissenschaftlicher und medizinischer ForschungPeer-reviewte wissenschaftliche und medizinische Open-Access-Zeitschriften.Dove Medical Press ist Mitglied des OAI.Massennachdrucke für die pharmazeutische Industrie.Wir bieten unseren Autoren echte Vorteile, einschließlich einer beschleunigten Bearbeitung von Papieren.Registrieren Sie Ihre spezifischen Daten und spezifischen Arzneimittel von Interesse und wir gleichen die von Ihnen bereitgestellten Informationen mit Artikeln aus unserer umfangreichen Datenbank ab und senden Ihnen umgehend PDF-Kopien per E-Mail zu.Zurück zu Zeitschriften » International Journal of Nanomedicine » Volume 14Ein Genipin-vernetztes Protein-Polymer-Hybridsystem für den intrazellulären Transport von Ribonuklease AAutoren Liang X, Tang X, Yang J, Zhang J, Han H, Li QVeröffentlicht am 10. September 2019 Band 2019:14 Seiten 7389—7398DOI https://doi.org/10.2147/IJN.S210486Begutachtung durch einmaliges anonymes Peer-ReviewHerausgeber, der die Veröffentlichung genehmigt hat: Prof. Dr. Anderson Oliveira LoboXiao Liang, Xiuhui Tang, Jiebing Yang, Jiayuan Zhang, Haobo Han, Quanshun Li Key Laboratory for Molecular Enzymology and Engineering of Ministry of Education, School of Life Sciences, Jilin University, Changchun 130012, Volksrepublik China Korrespondenz: Haobo Han;Quanshun Li Key Laboratory for Molecular Enzymology and Engineering of Ministry of Education, School of Life Sciences, Jilin University, Changchun 130012, Volksrepublik China Tel +86 4 318 515 5201 Fax +86 4 318 515 5200 E-Mail [email protected];[E-Mail-geschützt] Hintergrund: Therapeutische Proteine ​​werden in großem Umfang bei der Behandlung verschiedener Erkrankungen eingesetzt, und wirksame Träger werden dringend benötigt, um eine Proteinabgabe zu erreichen, um eine günstige Behandlungswirksamkeit zu erreichen.Materialien und Methoden: Ein Protein-Polymer-Hybridsystem wurde durch Genipin-vermittelte Vernetzung von Polyethylenimin mit einem gewichtsmittleren Molekulargewicht von 25.000 g/mol (PEI25K) und Ribonuklease A (RNase A), nämlich RGP, konstruiert.Ergebnisse: Es wurde beobachtet, dass die RGP-Nanopartikel aufgrund der Einführung von positiv geladenem PEI25K leicht in HeLa-Zellen internationalisiert werden, wodurch die antiproliferative Wirkung durch Spaltung von RNA-Molekülen in den Tumorzellen ausgelöst wird.Darüber hinaus konnte in den Tumorzellen nach RGP-Abgabe offensichtlich eine rote Fluoreszenz sichtbar gemacht werden, was auf die intrinsischen Eigenschaften von Genipin zurückgeführt wurde.Schlussfolgerung: Das durch Genipin-vermittelte Vernetzung hergestellte Protein-Polymer-Hybridsystem hat das Potenzial, als theranostische Plattform sowohl für die In-vivo-Bildgebung als auch für den Transport verschiedener therapeutischer Proteine ​​verwendet zu werden.Schlüsselwörter: Genipin, Polyethylenimin, Ribonuklease A, Proteintransport, AntitumorwirksamkeitIn den letzten zwei Jahrzehnten wurde eine Reihe von therapeutischen Proteinen oder Peptiden, darunter Wachstumsfaktoren, Zytokine, Antikörper und Enzyme, aufgrund des schnellen Fortschritts biotechnologischer Techniken erfolgreich entwickelt.1,2 Inzwischen hat die proteinbasierte Therapie ein großes Potenzial in der Behandlung verschiedener Krankheiten aufgrund der Eigenschaften hoher pharmakologischer Wirksamkeit und geringer Toxizität.3,4 Unter ihnen könnte die zytotoxische Ribonuklease A (RNase A) die Spaltung der intrazellulären RNA-Moleküle erreichen und die Zellapoptose induzieren, was nachweislich der Fall ist besitzen eine günstige Abtötungsfähigkeit gegen Tumorzellen.5–10 Dennoch ist es immer noch eine große Herausforderung, eine effektive Bioverfügbarkeit und klinische Anwendungen von Proteinen zu erreichen, was hauptsächlich auf ihre geringe Stabilität, ihren leichten Proteaseabbau und ihre schlechte Membrandurchlässigkeit zurückzuführen ist.11–13Ermutigt durch die jüngste Entwicklung der Nanotechnologie haben Nanocarrier, darunter anorganische Nanopartikel, kationische Lipide, Protamine, Peptide und Polymere, unverzichtbare Werkzeuge für den intrazellulären Transport von Proteinen bereitgestellt, was zu einer Verbesserung der Stabilität, Permeabilität und Bioverfügbarkeit von Ladungen geführt hat.11,13–22 Insbesondere Polyethylenimin (PEI) wurde weithin als Genträger eingesetzt, da seine aminoreiche Struktur eine hohe Dichte an positiver Ladung bereitstellen und die Zellaufnahme durch die elektrostatische Wechselwirkung mit der negativ geladenen Zellmembran weiter fördern könnte.23,24 Darüber hinaus es könnte das lysosomale Entweichen durch den „Protonenschwamm“-Effekt erleichtern und die Nutzlast vor dem Abbau in der sauren und enzymatischen Umgebung von Endo/Lysosomen schützen.25,26 In unserem vorherigen Bericht wurde PEI25K erfolgreich mit thermophilem Histon über Genipin vernetzt, um a herzustellen Protein-Polymer-Hybrid-Genträger, der eine günstige Biokompatibilität zeigte und zhervorragende Transfektionseffizienz aufgrund der synergistischen Effekte zwischen diesen beiden Komponenten.27 In diesem System wurde Genipin, das enzymatische Produkt von Geniposid aus der Frucht der Gardenie, als Vernetzungsmittel verwendet, das eine günstige Aktivität mit primären Amingruppen und kolorimetrischen und fluorogene Aktivität.28–30 Daraus schließen wir, dass die Genipin-vermittelte Vernetzung ein leistungsfähiges Werkzeug zum Aufbau von Protein-Polymer-Hybridsystemen für den Transport therapeutischer Proteine ​​sein wird.Hier wurde ein Protein-Polymer-Hybridsystem durch die Genipin-vermittelte Vernetzung von PEI25K und RNase A synthetisiert, um den intrazellulären Transport von RNase A, nämlich RGP, zu realisieren (Schema 1).Da RNase A ein therapeutisches Protein mit günstiger Antitumorwirksamkeit ist,5–10 wurden die intrazelluläre Abgabe und die weiteren antiproliferativen Wirkungen von RGP systematisch untersucht.Schema 1 Der synthetische Ansatz des RNase A-PEI25K-Hybridsystems (RGP) über Genipin-vermittelte Vernetzung.Schema 1 Der synthetische Ansatz des RNase A-PEI25K-Hybridsystems (RGP) über Genipin-vermittelte Vernetzung.Verzweigtes PEI25K (Verunreinigungen: ≤ 1 % Wasser) und Rinderpankreas-RNase A (≥ 70 kU/mg Protein) wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MS, USA) bezogen.Genipin (> 98 %) wurde von Zhixin Biotechnol bereitgestellt.Co. (Linchuan, China).Das RNaseAlert®-Kit wurde von Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA, USA) bezogen.FBS und DMEM wurden von Kangyuan Co. (Peking, China) bzw. Gibco (Grand Island, NE, USA) bezogen.Das BCA-Protein-Assay-Kit wurde von BioTeke Co. (Peking, China) bereitgestellt.Der Proteinmarker Blue plus II wurde von TransGen Biotech bezogen.(Peking, China).BSA und MTT wurden von Amresco (Solon, OH, USA) gekauft.Das LIVE/DEAD® Viabilitäts-/Zytotoxizitäts-Kit und das einstufige TUNEL-Zell-Apoptose-Nachweis-Kit wurden von Thermo Fisher (Grand Island, NE, USA) bzw. Beyotime (Jiangsu, China) bezogen.Das Apoptose-Nachweiskit Annexin V-FITC/PI wurde von Vazyme Co. (Nanjing, China) bereitgestellt.Kurz gesagt, RNase A (0,01 &mgr;mol) wurde mit 5 ml PEI25K-Lösung (0,10 &mgr;mol) gemischt, und Genipin (0,01 &mgr;mol) wurde in die Mischung gegeben.Nach Rühren bei 4°C für 24 Stunden wurden die Proben gegen destilliertes Wasser für 24 Stunden dialysiert, um überschüssiges Genipin zu entfernen (MWCO: 3500 Da).Das Produkt RGP wurde durch Gefriertrocknung erhalten und anschließend einer systematischen Charakterisierung unterzogen.Die Fourier-transformierten Infrarotspektrometrie (FTIR)-Spektren wurden im Bereich von 4000–600 cm-1 unter Verwendung von KBr-Pellets auf einem Bruker V70 FTIR-Spektrometer aufgenommen.Die UV-Vis-Spektren wurden auf einem Shimadzu 2700-Spektrophotometer im Wellenlängenbereich von 190–350 nm aufgenommen.Die MALDI-TOF-Massenspektren wurden auf einem Massenspektrometer AB SCIEX 5800 aufgenommen.SDS-PAGE wurde auf 15 % Polyacrylamidgel mit 15 &mgr;g Protein pro Vertiefung (80 V, 150 min) durchgeführt, wobei die Konzentration von RNase A in RGP unter Verwendung des BCA-Protein-Assay-Kits gemessen wurde.Circulardichroismus-Spektren im fernen UV wurden auf einem JASCO 810-Instrument im Bereich von 190–250 nm mit einer Scangeschwindigkeit von 100 nm/min aufgenommen, wobei 1 mg/ml RNase A-Konzentration in destilliertem Wasser zur Analyse verwendet wurde.Das Bild der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) von RGP-Nanopartikeln wurde mit einem HITACHI-H800-Mikroskop bei einer Beschleunigungsspannung von 200 kV aufgenommen.Der hydrodynamische Durchmesser und das Zeta-Potential von RGP-Nanopartikeln wurden unter Verwendung eines Malvern Nano ZS90 Zetasizer (Malvern, UK) bestimmt.Die enzymatischen Aktivitäten von RNase A und RGP wurden unter Verwendung des RNaseAlert®-Kits gemäß dem Protokoll des Herstellers gemessen.10 μl RNaseAlert®-Substrat wurden zunächst mit 10 μl Assay-Puffer gemischt, der im Kit enthalten ist.Dann wurden 80 &mgr;l RNase A- oder RGP-Lösung mit einer RNase A-Konzentration von 1 &mgr;g/ml einzeln in die obige Lösung gegeben.Die Fluoreszenzintensität bei 520 nm (angeregt bei 490 nm) wurde innerhalb von 30 min überwacht.Die HeLa-Zellen wurden vom Shanghai Institute of Cell Bank (Shanghai, China) erhalten und in Platten mit 6 Vertiefungen mit einer Dichte von 3,0 × 10 5 Zellen/Vertiefung inokuliert.Nach der Kultur bei 37°C über Nacht vor der Transfektion wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden mit RGP in unterschiedlichen Konzentrationen (0,5–8,0 μg/ml RNase A) in FBS-freiem DMEM für 4 Stunden inkubiert.Dann wurde das Medium verworfen und die Zellen gesammelt, in 1 ml PBS suspendiert und durch Calibur-Durchflusszytometrie (BD Bioscience, Mountain View, USA) mit Anregungs- und Emissionswellenlängen von 488 bzw. 575 nm analysiert.Für die Analyse mit dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) wurden HeLa-Zellen in Platten mit 6 Vertiefungen mit sterilisierten Deckgläsern in einer Dichte von 2,2 × 10 5 Zellen/Vertiefung ausgesät und über Nacht bei 37°C kultiviert.Anschließend wurden nach Entfernen des Mediums 2 ml FBS-freies DMEM in jede Vertiefung gegeben, und die Zellen wurden mit 4 &mgr;g/ml RGP-Lösung für 6 Stunden transfiziert.Das Medium wurde nach der Transfektion verworfen und die Zellen dreimal mit PBS gewaschen, 15 min mit 4 % Paraformaldehydlösung fixiert und 5 min mit DAPI-Lösung (1 μg/ml) gefärbt.Schließlich wurden die Deckgläser auf einem LSM 710 CLSM (Carl Zeiss Microscopy LLC, Jena, Deutschland) betrachtet.Die HeLa-Zellen wurden in eine Platte mit 6 Vertiefungen mit einem sterilisierten Deckglas bei einer Anfangsdichte von 2,5 × 10 5 Zellen/Vertiefung inokuliert und über Nacht bei 37°C kultiviert.Anschließend wurden die Zellen mit 1 ml FBS-freiem DMEM, das RGP-Nanopartikel (RNase-A-Konzentration von 4 μg/ml) enthielt, für 2 bzw. 6 Stunden inkubiert.Danach wurden die Zellen mit LysoTracker Green DND-26 (ThermoFisher, Eugene, OR) für 5 Minuten gefärbt, wie in früheren Berichten beschrieben.31–33 Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit 4 % Paraformaldehydlösung für 15 Minuten fixiert und gefärbt mit DAPI-Lösung (1 μg/ml) für 5 min.Schließlich wurde das Deckglas der Analyse auf einem LSM 710 CLSM (Carl Zeiss Microscopy LLC) unterzogen, um das endosomale Entweichen von RGP-Nanopartikeln nachzuweisen.Der MTT-Assay wurde eingesetzt, um die antiproliferative Wirkung von RNase A und RGP in vitro zu bewerten, wobei gemäß früheren Berichten 0,1 % Triton X-100 als Positivkontrolle verwendet wurde.18,34 Vertiefungsplatten mit einer Dichte von 8.000 Zellen/Vertiefung und bei 37°C über Nacht inkubiert.Die Zellen wurden dann mit 0,1 % Triton X-100, PEI25K, RNase A und RGP mit unterschiedlichen RNase A-Konzentrationen inkubiert.Nach der Behandlung für 24 Stunden wurden 20 &mgr;l MTT-Lösung (5 mg/ml) in jede Vertiefung gegeben und die Zellen wurden für weitere 4 Stunden inkubiert.Anschließend wurde die MTT-Lösung entfernt und Dimethylsulfoxid (200 &mgr;l) wurde in jede Vertiefung gegeben, um die Formazan-Kristalle aufzulösen.Die Extinktion bei 570 nm wurde unter Verwendung eines HBS-1906A-Mikroplattenlesegeräts (Nanjing, China) gemessen, und die Zelllebensfähigkeit wurde basierend auf den Extinktionswerten der behandelten und unbehandelten Gruppen berechnet.Kurz gesagt wurden HeLa-Zellen in Platten mit 6 Vertiefungen mit einer Dichte von 2,2 × 10 5 Zellen/Vertiefung ausgesät und über Nacht bei 37°C inkubiert.Die Zellen wurden mit 0,1 % Triton X-100, PEI25K, RNase A und RGP für 48 Stunden (RNase A-Konzentration von 4 &mgr;g/ml) behandelt und zweimal mit PBS gewaschen.Gemäß den Anweisungen des Herstellers wurden die Zellen mit Lebend/Tot-Färbereagenzien für 30 Minuten gefärbt, dreimal mit PBS gewaschen und auf einem IX71-Fluoreszenzmikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) beobachtet.Die HeLa-Zellen wurden in Platten mit 6 Vertiefungen mit einer Dichte von 2,2 × 10 5 Zellen/Vertiefung ausgesät und über Nacht bei 37°C kultiviert.Dann wurden die Zellen mit 0,1 % Triton X-100, PEI25K, RNase A und RGP für 48 Stunden (RNase A-Konzentration von 4 &mgr;g/ml) behandelt.Gemäß dem Protokoll des Herstellers wurden die gesammelten Zellen mit den entsprechenden Lösungen im Kit behandelt und die Zellapoptose auf einer Calibur-Durchflusszytometrie (BD Bioscience) getestet.Die HeLa-Zellen wurden in Platten mit 6 Vertiefungen mit einer Dichte von 2,2 × 10 5 Zellen/Vertiefung ausgesät und über Nacht bei 37°C kultiviert.Nach Behandlung mit 0,1 % Triton X-100, PEI25K, RNase A und RGP für 48 Stunden (RNase A-Konzentration von 4 &mgr;g/ml) wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und mit 75 % Ethanol für 30 Minuten fixiert.Anschließend wurde dreimal mit PBS gespült, die Zellen wurden in PBS suspendiert, das 0,3 % Triton X-100 enthielt, und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.Gemäß dem Protokoll des Herstellers wurden die Zellen mit TUNEL-Nachweislösung im Kit für 1 Stunde inkubiert, dreimal mit PBS gewaschen und unter Verwendung eines IX71-Fluoreszenzmikroskops (Olympus) nachgewiesen.Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt, und die statistische Signifikanz der Unterschiede wurde durch einfache ANOVA unter Verwendung von SPSS Statistics 23.0, ergänzt durch Student's t-Test, analysiert (ns, nicht signifikant; *p<0,05; **p<0,01).Das Protein-Polymer-Hybridsystem RGP wurde durch die Genipin-vermittelte Vernetzung von RNase A und PEI25K (Schema 1), einem Aglycon von Geniposid, das als natürliches Vernetzungsmittel weit verbreitet ist, synthetisiert.27,30 Dann wurde die Struktur von RGP gekennzeichnet durch FTIR, wie in Abbildung 1 gezeigt. Offensichtlich wurden die von RNase A erzeugten RGP-Banden für die Proteinamid-I-Bande bei 1639 cm –1 und die NH-Streckschwingung bei 3338 cm –1 beobachtet, während die charakteristischen Banden von der Komponente PEI25K wurden als CH-Streckschwingung bei 2938 und 2810 cm-1, CH-Biegeschwingung bei 1455 cm-1, NH-Streckschwingung bei 3277 cm-1 und CN-Streckschwingung bei 1115 und 1046 cm-1 bestätigt.Daher zeigten die FTIR-Spektren deutlich das Vorhandensein charakteristischer Peaks von sowohl RNase A als auch PEI25K im Produkt RGP.Darüber hinaus konnte im Vergleich zu RNase A eine leichte Rotverschiebung der maximalen Absorptionswellenlänge von RGP im UV-Vis-Spektrum beobachtet werden (Abbildung 2).Da in den UV-Vis-Spektren von PEI25K, Genipin und dem Produkt der Genipin-vermittelten Vernetzung von PEI25K (Abbildung S1) keine Absorption vorhanden war, wurde die Rotverschiebung von RGP wahrscheinlich durch die durch die Genipin-Vernetzung induzierte Strukturänderung von RNase A verursacht .Weiterhin wurde das Molekulargewicht von RGP durch MALDI-TOF-Massenspektrum und SDS-PAGE-Analyse bestimmt.Wie in Fig. 3 gezeigt, betrug das Molekulargewicht von RNase A 13,7 kDa, und der Wert von RGP stieg auf 66,3 kDa, was anzeigt, dass RNase A erfolgreich mit PEI25K vernetzt wurde.Ähnliche Ergebnisse konnten bei der SDS-PAGE-Analyse beobachtet werden, bei der eine Hauptbande mit einem Molekulargewicht von 66,0 kDa für die Probe RGP nachgewiesen wurde (Fig. 4).Interessanterweise konnten, anders als bei der einzelnen Bande von RNase A, für RGP nachlaufende Banden mit unterschiedlichen Molekulargewichten gefunden werden.Dieses Phänomen wurde wahrscheinlich durch die Genipin-vermittelte Quervernetzung von RNase A und PEI25K in verschiedenen molaren Verhältnissen verursacht.Außerdem könnte auch eine Mischung von Ketten mit unterschiedlichen Molekulargewichten in PEI25K zu diesen Ergebnissen beitragen.Insgesamt bestätigten alle diese Ergebnisse eindeutig die erfolgreiche Vernetzung von PEI25K und RNase A, vermittelt durch Genipin.Abbildung 1 FTIR-Spektrenanalyse von PEI25K, RNase A und RGP.Abbildung 2 UV-Vis-Spektren von RNase A und RGP.Abbildung 3 Die MALDI-TOF-Massenspektren von RNase A und RGP.Fig. 4 SDS-PAGE-Analyse von RNase A und RGP.Spur 1: Markierung;Spur 2: RNase A;und Spur 3: RGP.Abbildung 1 FTIR-Spektrenanalyse von PEI25K, RNase A und RGP.Abbildung 2 UV-Vis-Spektren von RNase A und RGP.Abbildung 3 Die MALDI-TOF-Massenspektren von RNase A und RGP.Fig. 4 SDS-PAGE-Analyse von RNase A und RGP.Spur 1: Markierung;Spur 2: RNase A;und Spur 3: RGP.Anschließend wurden die Morphologie, der hydrodynamische Durchmesser und das Zetapotential von RGP charakterisiert.Wie in Abbildung S2 gezeigt, zeigte das TEM-Bild die sphärische Struktur von RGP-Nanopartikeln mit einer Partikelgröße von ca.200 Nanometer.Dann wurden der hydrodynamische Durchmesser und die Zetapotentialwerte von RGP-Nanopartikeln mit 193,1 ± 18,3 nm bzw. +15,1 ± 2,8 mV bestimmt (Abbildung S3).Somit machten die günstige Partikelgröße und positive Ladungsdichte von RGP-Nanopartikeln sie geeignet, um die zelluläre Aufnahme in Tumorzellen zu erreichen.Um die Reproduzierbarkeit dieser Strategie weiter nachzuweisen, wurden drei Chargen von RGP-Nanopartikeln hergestellt und anschließend eine SDS-PAGE, eine hydrodynamische Durchmesser- und eine Zetapotenzialanalyse durchgeführt (Abbildungen S4 und S5).Es gab eindeutig keine deutlichen Unterschiede zwischen diesen Proben, was auf die gute Reproduzierbarkeit von RGP-Nanopartikeln hinweist.Um zu bewerten, ob die Genipin-vermittelte Vernetzungsreaktion die enzymatische Aktivität beeinflussen könnte, wurde die Aktivität von RGP unter Verwendung eines kommerziellen RNase-A-Aktivitätsnachweiskits gemessen.Wie in Abbildung 5 gezeigt, wurde beobachtet, dass die Fluoreszenzintensität von RNase A und RGP in einem frühen Stadium schnell zunahm und dann nach 15 Minuten konstant wurde, was die günstige enzymatische Aktivität von RGP-Nanopartikeln zeigte.Im Vergleich zu freier RNase A war die RGP-Aktivität leicht um ca.27%, aber es blieb immer noch aktiv.Gleichzeitig wurde die Sekundärstruktur von RNase A und RGP durch Circulardichroismus-Spektren im fernen UV bestimmt (Abbildung 6).Sowohl RNase A als auch RGP zeigten eindeutig eine typische α-Helix-Konformation mit zwei Tälern bei Wellenlängen bei 209 und 222 nm.Basierend auf der Online-Analyse mit der Software K2D2 (http://cbdm-01.zdv.uni-mainz.de/~andrade/k2d2/) wurde festgestellt, dass der Gehalt an α-Helix nach dem Genipin-Crosslinking (15,43 % und 9,86 % für RNase A bzw. RGP).Unterdessen stieg der β-Faltblatt-Gehalt von 26,43 % in RNase A auf 41,03 % in RGP-Nanopartikeln.Somit war die Veränderung der Sekundärstruktur wahrscheinlich ein Hauptgrund für die leichte Deaktivierung von RNase A in der RGP-Gruppe.Abbildung 5 Die enzymatische Aktivität von RNase A- und RGP-Nanopartikeln.Abbildung 6 Circulardichroismus-Spektren von RNase A und RGP.Abbildung 5 Die enzymatische Aktivität von RNase A- und RGP-Nanopartikeln.Abbildung 6 Circulardichroismus-Spektren von RNase A und RGP.Aufgrund der Einführung von kationischem PEI25K wird erwartet, dass das Hybridsystem RGP für die Wechselwirkung mit der Zellmembran günstig ist, wodurch die zelluläre Aufnahme erleichtert wird.Die Liefereffizienz von RGP wurde durch Durchflusszytometrie und CLSM bewertet, wobei HeLa-Zellen als Modell verwendet wurden (Abbildung 7).Offensichtlich konnte aufgrund der intrinsischen Eigenschaft von Genipin in der RGP-Probe eine rote Fluoreszenz in HeLa-Zellen nachgewiesen werden, was auf die intrazelluläre Aufnahme von RNase A hinweist. Unterdessen zeigte das Phänomen, dass RGP-Nanopartikel die einzigartige Eigenschaft von Genipin nach der Vernetzungsreaktion beibehalten konnten.Im Allgemeinen übte RNase A ihre Antitumorfunktion im Zytosol aus,35,36 aber unsere Ergebnisse zeigten, dass einige RGP-Nanopartikel eine Verteilung im Zellkern aufwiesen.Diese Ergebnisse bedeuteten, dass die RGP-Nanopartikel nach der zellulären Aufnahme effizient den endosomalen Austritt erreichen und sogar in den Zellkern gelangen konnten.Daher führten wir die endosomale Fluchtanalyse von RGP-Nanopartikeln durch CLSM-Bilder durch (Abbildung 8).Nach 2 Stunden konnte eine offensichtliche Kolokation von grüner und roter Fluoreszenz beobachtet werden, was den Eintritt von RGP-Nanopartikeln in Lysosomen impliziert.Allerdings konnte im Cytosol nach 6 Stunden eine starke rote Fluoreszenz nachgewiesen werden, die nicht mit grüner Fluoreszenz verschmolzen war.Daraus konnte geschlossen werden, dass RGP-Nanopartikel aufgrund des „Protonenschwamm“-Effekts der PEI25K-Komponente ein effizientes endosomales Entkommen realisieren könnten.Darüber hinaus zeigte die durchflusszytometrische Analyse, dass die Fluoreszenzintensität von RGP mit der Verbesserung der RNase-A-Konzentration im System eine zunehmende Tendenz aufwies ( 7B und C).Diese Ergebnisse implizierten, dass die Fluoreszenzintensität in den Tumorzellen in Abhängigkeit von der RNase A-Dosis zunahm.Bemerkenswerterweise konnten fast alle Nanopartikel von den Zellen bei einer RNase-A-Konzentration von 8 μg/ml mit einer Abgabeeffizienz von 97,9 % aufgenommen werden.Insgesamt konnte das Protein-Polymer-Hybridsystem RGP aufgrund der Einführung des kationischen Trägers PEI25K eine effiziente intrazelluläre Abgabe des therapeutischen Proteins RNase A realisieren und somit wahrscheinlich eine ideale Antitumorwirksamkeit erreichen.Abbildung 7 In-vitro-Liefereffizienzanalyse von RGP.(A) Die CLSM-Bilder von HeLa-Zellen nach der Behandlung mit RGP für 6 Stunden.Maßstabsleiste: 100 μm.(B) Die zelluläre Aufnahmeanalyse von RGP mit unterschiedlichen Konzentrationen von RNase A in HeLa-Zellen durch Durchflusszytometrie.(C) Die quantitative Analyse basierend auf Durchflusszytometrie für die Liefereffizienz von RGP.Abbildung 8 Endosomale Escape-Analyse von RGP-Nanopartikeln durch CLSM.Der Maßstabsbalken beträgt 50 μm.Abbildung 7 In-vitro-Liefereffizienzanalyse von RGP.(A) Die CLSM-Bilder von HeLa-Zellen nach der Behandlung mit RGP für 6 Stunden.Maßstabsleiste: 100 μm.(B) Die zelluläre Aufnahmeanalyse von RGP mit unterschiedlichen Konzentrationen von RNase A in HeLa-Zellen durch Durchflusszytometrie.(C) Die quantitative Analyse basierend auf Durchflusszytometrie für die Liefereffizienz von RGP.Abbildung 8 Endosomale Escape-Analyse von RGP-Nanopartikeln durch CLSM.Der Maßstabsbalken beträgt 50 μm.Nach der erfolgreichen Internalisierung von RGP wurden die in vitro antiproliferativen Wirkungen von RNase A, PEI25K und RGP gegen HeLa-Zellen mittels MTT-Assay bewertet.In der vorliegenden Studie wurde 0,1 % Triton X-100 als Positivkontrolle eingesetzt und die Ergebnisse sind in Abbildung S6 zusammengefasst.Wie in Abbildung 9 gezeigt, zeigten RGP-Nanopartikel im Vergleich zu PEI25K und RNase A offensichtliche antiproliferative Wirkungen bei einer RNase A-Konzentration von 4 und 5 μg/ml, aufgrund der erfolgreichen intrazellulären Abgabe von RNase A und der weiteren Spaltung von RNA-Molekülen im Tumor Zellen.Unterdessen zeigten RGP-Nanopartikel dosisabhängig antiproliferative Wirkungen mit nur 43,9 % der Zelllebensfähigkeit bei einer RNase-A-Konzentration von 5 μg/ml.Darüber hinaus konnten in der RGP-Gruppe durch Lebend/Tot-Färbeassay (Abbildung 10) mehr tote Zellen beobachtet werden, wobei die toten Zellen nach der Färbung mit Ethidium-Homodimer rote Fluoreszenz emittieren, während die lebensfähigen Zellen aufgrund des Calceinacetoxymethylesters (Calcein AM)-Färbung.37 Somit demonstrierten alle diese Ergebnisse die hervorragenden antiproliferativen Wirkungen von RGP-Nanopartikeln aufgrund der erfolgreichen Abgabe von RNase A mit günstiger Antitumorantwort.Abbildung 9 In-vitro-Assay der antiproliferativen Wirkung von HeLa-Zellen nach der Behandlung mit PEI25K, RNase A und RGP-Nanopartikeln, wobei die Konzentration von RNase A für die RGP-Nanopartikel verwendet wurde.Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung von Dreifachversuchen (* p < 0,05) dargestellt.Fig. 10 Lebend/Tot-Färbungsassay von HeLa-Zellen nach der Behandlung mit RNase A und RGP.Der Maßstabsbalken beträgt 200 μm.Abbildung 9 In-vitro-Assay der antiproliferativen Wirkung von HeLa-Zellen nach der Behandlung mit PEI25K, RNase A und RGP-Nanopartikeln, wobei die Konzentration von RNase A für die RGP-Nanopartikel verwendet wurde.Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung von Dreifachversuchen (* p < 0,05) dargestellt.Fig. 10 Lebend/Tot-Färbungsassay von HeLa-Zellen nach der Behandlung mit RNase A und RGP.Der Maßstabsbalken beträgt 200 μm.Um weiter zu validieren, ob die proliferative Hemmung mit der Zellapoptose assoziiert war, wurden HeLa-Zellen nach der RGP-Behandlung intuitiv durch TUNEL-Färbung visualisiert.Wie in Abbildung 11 gezeigt, konnten gleichzeitig nach der Behandlung mit RGP für 48 Stunden eine offensichtliche strukturelle Verformung des Zellkerns und eine stärkere grüne Fluoreszenz beobachtet werden, was darauf hinweist, dass RGP-Nanopartikel die Zellapoptose effizient induzieren könnten.Darüber hinaus wurde die Zellapoptose durch durchflusszytometrische Analyse nach Zellfärbung mit Annexin V-FITC und PI gemessen (Abbildung 12).Im Vergleich zur Kontrollgruppe induzierte freie RNase A keine Apoptose, und für die PEI25K-Behandlung konnte nur ein geringes Apoptoseverhältnis nachgewiesen werden, was wahrscheinlich auf der intrinsischen Zytotoxizität von PEI25K beruhte.Bemerkenswerterweise konnte für die RGP-Gruppe eine deutliche Induktion von Zellapoptose mit einem Gesamtapoptoseverhältnis von ca.46,2 %.Somit wurde die durch RGP-Nanopartikel ausgelöste antiproliferative Wirkung auf die Induktion von Zellapoptose nach erfolgreicher intrazellulärer Abgabe des therapeutischen Proteins RNase A zurückgeführt.Fig. 11 TUNEL-Assay von HeLa-Zellen nach der Behandlung mit RNase A und RGP.Der Maßstabsbalken beträgt 200 μm.Abbildung 12 Die Zellapoptoseanalyse von HeLa-Zellen nach der Behandlung mit verschiedenen Proben durch Durchflusszytometrie: (A) Kontrolle;(B) RNase A;(C) PEI25K;und (D) RGP-Nanopartikel.Fig. 11 TUNEL-Assay von HeLa-Zellen nach der Behandlung mit RNase A und RGP.Der Maßstabsbalken beträgt 200 μm.Abbildung 12 Die Zellapoptoseanalyse von HeLa-Zellen nach der Behandlung mit verschiedenen Proben durch Durchflusszytometrie: (A) Kontrolle;(B) RNase A;(C) PEI25K;und (D) RGP-Nanopartikel.Zusammenfassend wurden das therapeutische Protein RNase A und das kationische Polymer PEI25K unter Verwendung von Genipin als Vernetzer kovalent vernetzt, um ein Protein-Polymer-Hybrid-Nanopartikel zu konstruieren, das auf die effiziente intrazelluläre Abgabe von RNase A abzielt. Das RGP-Nanopartikel könnte effizient von Krebszellen mit a aufgenommen werden Liefereffizienz von 97,9 % und induzieren die Apoptose durch Spaltung der RNA-Moleküle im Zytosol (apoptotische Gesamtrate von 46,2 %), wodurch die Hemmung der Zellproliferation ermöglicht wird.Darüber hinaus machte die intrinsische rote Fluoreszenz von RGP aus der Einführung von Genipin es zu einem potenziellen theranostischen Verabreichungssystem, um eine Kombination aus proteinbasierter Therapie und In-vivo-Bildgebung zu erhalten.Insgesamt glauben wir, dass die Genipin-vermittelte Vernetzungstechnik ein vielversprechendes Werkzeug zur Erzielung der Abgabe therapeutischer Proteine ​​für die Behandlung verschiedener Krankheiten mit verbesserter therapeutischer Wirksamkeit und minimierten Nebenwirkungen darstellen wird.Die Autoren danken dem National Key R&D Program of China (2018YFC1105401), der National Natural Science Foundation of China (81673502 und 81872928), dem Province-University Cooperation Project of Jilin Province (SXGJQY2017-4), dem Science and Technology Department of Jilin Province für die Unterstützung (20190201288JC), Bildungsabteilung der Provinz Jilin (JJKH20190010KJ) und Graduate Innovation Program der Jilin University (10183201820).Die Autoren melden keine Interessenkonflikte in dieser Arbeit.1. 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